暴發于2019年底并持續蔓延的新型冠狀病毒肺炎疫情對全世界人民的健康和生活均造成了嚴重影響，經呼吸道飛沫和接觸傳播是新型冠狀病毒的主要傳播途徑^[1]。醫用口罩對于氣溶膠、飛沫等具有良好的過濾防護效果，且能夠預防呼吸系統疾病，其不僅是抗疫一線工作者必備的防護用品，還是人民群眾預防新型冠狀病毒肺炎的生活必需品^[2-3]。

目前，我國有3個醫用口罩相關標準。其中，國家標準GB 19083-2010《醫用防護口罩技術要求》^[4]是強制性標準，符合該標準的口罩稱為醫用防護口罩；行業標準YY 0469-2011《醫用外科口罩》^[5]也是強制性標準，符合該標準的口罩稱為醫用外科口罩；行業標準YY/T 0969-2013《一次性使用醫用口罩》^[6]是推薦性標準，符合該標準的口罩稱為醫用普通口罩。YY/T 0969-2013和YY 0469-2011對口罩的細胞毒性有技術要求，但未明確說明口罩主材和口罩帶是分別取材還是兩者按一定比例混合取材進行試驗，檢驗人員一般會選取口罩主材進行細胞毒性試驗，對口罩帶未做系統性研究，因此，相關標準宜對口罩的細胞毒性要求進行細化^[7-8]。本研究選取了國內14個廠家的16種醫用口罩（市售5種，注冊中11種），在現行安全使用的前提下依據GB/T 16886.5-2017《醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》^[9]對口罩帶的細胞毒性進行了研究，以期為相關標準修訂時對口罩帶細胞毒性做出合理要求提供數據支持。

1 材料

1.1  主要試劑

L-929細胞，由美國菌種保藏中心提供；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），由Sigma Aldrich公司提供，規格1g/瓶；MEM培養基，由CORNING MEM培養基公司提供，規格500ml/瓶；小牛血清，由天津康源生物技術有限公司提供，規格200ml/瓶；異丙醇，由西隴化工股份有限公司提供，規格500ml/瓶；二甲基亞砜，由國藥集團化學試劑有限公司提供，規格500ml/瓶。

1.2  儀器

臺式恒溫振蕩器，型號THZ-D，由蘇州培英實驗設備有限公司提供；酶標儀，型號MultiskanMk3，由賽默飛世爾（上海）儀器有限公司提供；電子天平，型號BSA3202S-CW，由賽多利斯科學儀器（北京）有限公司提供。

1.3  試驗樣品

1.3.1  被檢樣品

將來自14個國內廠家的16種醫用口罩依次編號為1^#、2^#、3^#、4^#、5^#、6^#、7^#、8^#、9^#、10^#、11^#、12^#、13^#、14^#、15^#、16^#，基本信息見表1。

表1 16種醫用口罩的基本信息

1.3.2  對照樣品

陽性對照樣品選擇5%（V/V）的二甲基亞砜，陰性對照樣品選擇高密度聚乙烯^[9-10]。

2 方法

2.1  MTT溶液的配制

將5mg MTT溶于1ml磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為5g/L的溶液，過濾滅菌，分裝后避光保存在-20℃冰箱中，使用前用完全培養基稀釋至1g/L。

2.2  浸提液的制備 

被檢樣品：對于1^#~3^#被檢樣品，浸提比例選擇0.2g/ml（無吸收性的固體器械），浸提條件為（37±1）℃、24h；對于4^#~16^#被檢樣品，浸提比例選擇0.1g/ml（低密度材料），浸提條件為（37±1）℃、24h^[10]。

對照樣品：陽性對照樣品無需浸提，直接使用；陰性對照樣品浸提比例選擇0.2g/ml，浸提條件為（37±1）℃、24h^[10]。

2.3  試驗方法

將配制好的濃度為1×105/ml的L-929細胞懸液每孔100µl接種于96孔培養板上，設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和被檢樣品組，每組至少各設6個復孔。第1次試驗：每個被檢樣品（1^#~16^#）均分為浸提液組和1/2浸提液組。第2次試驗：只選取1^#、2^#、3^#、4^#被檢樣品進行試驗，將這4個被檢樣品的浸提液做梯度稀釋，每個被檢樣品均分為1/2浸提液組、1/4浸提液組、1/8浸提液組和1/12浸提液組。

將96孔培養板置于二氧化碳培養箱（二氧化碳濃度為5%）中，37℃培養24h，然后置于顯微鏡下觀察，當細胞表現為約50%滿度單層生長時，棄凈原培養液，空白對照組加入新鮮細胞培養液，陰性對照組加入陰性對照樣品浸提液，陽性對照組加入陽性對照樣品浸提液，被檢樣品組加入相應稀釋比例的浸提液，每孔100µl，置于二氧化碳培養箱中，37℃繼續培養24h。

培養24h后，再次置于顯微鏡下觀察細胞形態，棄凈孔內培養液，每孔加入質量濃度為1g/L的MTT溶液50µl，37℃繼續培養2h后棄凈孔內液體，加入100µl異丙醇，置于振蕩器上振蕩10min，分別在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度，計算相對增殖率（relativegrowth rate，RGR）：

式中，RGR為相對增殖率（%），A為被檢樣品組、陰性對照組及陽性對照組的吸光度，AB為空白對照組的吸光度。

3 判定標準

細胞毒性分級按表2進行判定。

表2 細胞毒性分級

注：當被檢樣品100%浸提液的細胞RGR<70%時，被檢樣品50%浸提液的細胞RGR應等于或高于100%浸提液組，否則應重復試驗；當被檢樣品100%浸提液的細胞RGR≥70%時，被檢樣品50%浸提液的細胞RGR一般等于或高于100%浸提液，否則應重復試驗，但當RGR接近100%時，有可能出現相反情況，若反應體系正常，則無需重復試驗；RGR為相對增殖率。

4 結果

本研究中細胞毒性試驗采用的是GB/T 16886.5-2017中的MTT法，結果顯示，陰性對照樣品及陽性對照樣品的試驗結果均符合要求，試驗體系運行正常。依據被檢樣品細胞毒性情況，

4.1  被檢樣品第1次細胞毒性試驗

由表3可知，1^#~3^#被檢樣品的RGR在2.2%~2.3%范圍內，4^#~15^#被檢樣品的RGR在3.7%~56.9%范圍內，RGR均<70%；16#被檢樣品的RGR為88.2%。 

表3 第1次細胞毒性試驗結果

注：1/1表示100%的樣品浸提液，1/2表示稀釋2倍后的樣品浸提液；RGR為相對增殖率

4.2  被檢樣品第 2 次細胞毒性試驗

為探討有細胞毒性樣品的毒性程度，選擇1^#~4^#被檢樣品做進一步研究，將樣品浸提液稀釋2、4、8、12倍后進行試驗，結果見表4。

表4 第2次細胞毒性試驗結果

注：1/2、1/4、1/8、1/12分別表示稀釋2、4、8、12倍的樣品浸提液；RGR為相對增殖率

5  討論

1^#~3^#被檢樣品的口罩帶含有橡膠材質，浸提液細胞毒性相對較大；4#~15#被檢樣品的口罩帶為氨綸加滌綸或氨綸加錦綸材質，浸提液均有一定的細胞毒性，但毒性小于1^#~3^#被檢樣品；16^#被檢樣品的口罩帶為非織造布材質，無細胞毒性。

根據材料組成選取被檢樣品1^#、2^#、3^#及4^#（4^#作為4^#~15^#的代表）進一步探討細胞毒性程度。第2次細胞毒性試驗結果顯示，2#被檢樣品稀釋12倍后的浸提液的細胞RGR仍然只有1.4%；對于其他3個被檢樣品，隨著浸提液稀釋倍數的增加，其表現出的細胞毒性均逐漸減小，其中，1#和4#被檢樣品稀釋8倍后的浸提液的細胞RGR>70%，3^#被檢樣品稀釋12倍后的浸提液細胞RGR>70%。

醫用口罩一般由主體材料（非織造布）和其他材料（金屬鋁片、彈性材料等）組成。標準的醫用口罩一般采取將多層非織造布復合的形式，即由外部防水層、中間過濾層及內部吸濕層三部分構成^[11-12]。非織造布材料普遍被用于制造口罩的主體部分，是公認的比較安全、無細胞毒性的材料，本研究也說明了其是一種細胞毒性試驗合格的材料?，F有研究資料表明，含有橡膠材質的醫療器械，如天然膠乳橡膠避孕套、含有硅橡膠的一次性使用導尿管、醫用橡膠手套等，均具有不同程度的細胞毒性^[13-14]，表明橡膠是一種有一定細胞毒性的材料。本研究結果也表明，含有橡膠材質的口罩帶具有較大的細胞毒性，但多數產品稀釋12倍后的浸提液的RGR>70%，符合現行相關標準的要求，考慮到該類口罩產品已上市使用多年，未見由于口罩帶細胞毒性引起不良反應的報告，因此，可適當放寬對這類產品口罩帶細胞毒性的要求，如將按標準要求制備的浸提液稀釋8~12倍后進行細胞毒性試驗，若RGR≥70%，則其細胞毒性可接受?？傊?，為了確保醫用口罩使用安全，其相關標準宜對口罩帶細胞毒性做出適宜要求。

【參考文獻】

［1］左雙燕，陳玉華，曾翠，等 . 各國口罩應用范圍及相關標準介紹 [J].中國感染控制雜志，2020，19（2）：109-116.

［2］國家衛生健康委辦公廳，國家中醫藥管理局辦公室 .關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）的通知（國衛辦醫函﹝2010﹞103號）[EB/OL].（2020-02-05 ）[2020-02-06].http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-02/05/content_5474791.htm.

［3］國家衛生健康委員會 . 新型冠狀病毒感染不同風險人群防 護 指南 [EB/OL]. [2020-01-31].http://www.nhc. gov.cn/jkj/s7916/202001/a3a261dabfcf4c3fa365d4eb07ddab34.shtml.

［4］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會 . GB 19083-2010 醫用防護口罩技術要求 [S] . 北京：中國標準出版社，2010.

［5］國家食品藥品監督管理局，北京醫療器械質量監督檢驗中心 . YY 0469-2011 醫用外科口罩 [S]. 北京：中國標準出版社，2013.

［6］國家食品藥品監督管理局 . YY/T 0969-2013 一次性使用醫用口罩 [S]. 北京：中國標準出版社，2013.

［7］李明，田明偉 . 醫用口罩的技術標準對比研究及前景展望 [J]. 山東科學，2020，33（3）：28-34.

［8］常生，趙娟芝 . 我國醫用口罩標準對比解讀 [J]. 針織工業，2020（3）：14-17.

［9］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會 . GB/ T 16886.5-2017 醫療器械生物學評價 第5 部分：體外細胞毒性試驗 [S]. 北京：中國標準出版社，2017.

［10］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會 . GB/T 16886.12-2017 醫療器械生物學評價 第12 部分：樣品制備與參照材料選擇對照樣品 [S]. 北京：中國標準出版社，2017.

［11］葉小波，唐林，陳春亮，等 . 醫用口罩非織造材料研究進展 [J]. 紡織科技進展，2020（10）：11-14，18.

［12］程浩南 . 醫用防護領域的紡織材料應用概述 [J]. 化纖與紡織技術，2020，49（2）：16-20.

［13］閆明俞，沈曉麗，李海芳. 天然膠乳橡膠避孕套細胞毒性研究 [J].中國醫療器械信息，2020，26（19）：19-21.

［14］朱碧君，龔瑋，羅丹，等 . 一次性使用導尿管的生物學評價體系中細胞毒性試驗方法的研究 [J]. 江西化工，2016（6）：62-65.

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